prm-PASEF

摘要

与标准选择和平行反应监测(SRM和PRM)相比，PRM - pasef增加了在单一获取方法中可以靶向的肽的数量，而不影响选择性或灵敏度。利用原型采集软件，我们将201个同位素标记的合成肽(AQUA肽)添加到100 ng的人HeLa细胞系消化中。prm-PASEF对一些肽的定量限为17,2 amol，使用的采集方法可以在30分钟的LC梯度上监测216个前体。该方法注射间重现性好，定量准确。

作者

安东尼Lesur¹, Pierre-Olivier Schmit²,克里斯托弗•亚当斯^3.,贡纳·迪特玛¹；
1 LIH, Strassen，卢森堡;2 Bruker France S.A. Wissembourg，法国;3布鲁克道尔顿公司，美国圣何塞

关键词:

4 -蛋白质组学，prm-PASEF, timsTOF Pro, PASEF, LFQ，绝对定量，靶向蛋白质组学

靶向质谱是一种强大的技术，可以支持假设驱动的蛋白质组学实验，例如，在大样本队列中验证生物标志物候选。与依赖数据(DDA)和独立数据(DIA)的采集方法相比，它缓解了样本间缺失值的问题，但也提高了总体灵敏度。靶向蛋白质组以合成肽作为内标，对质谱信号进行归一化，最大限度地确定内源性肽的检测。

靶向蛋白质组学的一个主要限制是必须在单次试验中测量的目标数量、液相色谱分离的持续时间和总体灵敏度之间找到折衷。这仍然适用于当前的目标获取方法，包括SRM和PRM。因此，只有通过使用更长的色谱分离或降低质谱的灵敏度和选择性，才能实现大量目标肽的完整数据。像DIA这样的替代方法可以部分解决这个问题，并依靠使用宽m/z分离窗口的系统共分离和共*分离洗脱肽段。这种方法测量大多数肽，但在可实现的质谱周期(分析仪的扫描速度必须最小化)中，特异性和灵敏度有限(所有片段混合在一起)，而且不容易与短色谱梯度结合。

在本应用说明中，我们提出了prm-PASEF方法，这是PASEF获取策略的创新实现，克服了当前靶向蛋白质组学技术的限制。

在人细胞系消化液(100 ng/µL)中添加201个重水合肽和15个轻合成肽，如图1所示。用15个重质AQUA多肽和它们的轻质多肽生成了从5.5到50,000 amol/µl的9个浓度点的稀释曲线。这一套多肽作为内部标准。其余186条AQUA多肽在所有样品中均以2 fmol/µl的恒定浓度添加。

样品和对照样品以三次技术重复注射，使用250 mm拉射柱(澳大利亚IonOpticks)在纳米高效液相色谱(nanoElute, Bruker Daltonics)上进行分离，梯度为2-30%的乙腈，梯度为30分钟。多肽在prm- PASEF模式下运行的timsTOF Pro质谱仪(Bruker Daltonics)上分析。本研究采用单一的prm-PASEF方法:时间积累时间固定为50 ms，时间分离时间设置为100 ms。迁移率范围为0.65 ~ 1.3 1/K₀覆盖的m/z范围为100-1700 m/z。数据用Skyline-daily处理(20.1.1.83)。

定量性能是通过测量每个浓度水平的15重/轻比，并确定各自的浓度准确度和相对标准偏差来评估的。作为质量控制，用第一条曲线的线性回归反算两条曲线的浓度。定量限(LOQ)定义为80% <精度< 120%的最低浓度点，信号高于平均值(空白)+3×SD(空白)。

通过测量在恒定浓度下添加的186个重AQUA多肽的prm-PASEF痕迹的面积来评估复用性能。通过30次PRM - pasef运行计算色谱峰的面积和数据点数(使用最高的PRM过渡)的相对标准偏差(RSD)。

prm-PASEF采用了捕获离子迁移谱(tims)装置，极大地提高了方法的多路复用能力。这使得目标收购的大规模并行化不会对快速LC和UHPLC实现的灵敏度和更大的灵活性造成不利影响。tims细胞的捕获和洗脱原理(图2)允许在100 ms tims扫描事件中获得所有在离子迁移度维度上顺序洗脱的靶向肽。此外，时间聚焦效应增加了灵敏度，因为积累了100 ms的多肽，然后在5 ms峰洗脱到ms。

216个前体的洗脱时间以30分钟的梯度在22分钟内分散。在prm-PASEF中，采集窗口是三维的，隔离窗口必须根据色谱洗脱时间、离子迁移率和四极子隔离m/z确定。当我们将每个前体的保留窗口设置为40 s时，它在LC保留时间维度上产生了大量重叠。然而，IMS维度减少了最终获取窗口重叠，如图5a所示。在相同的prm-PASEF框架内测量具有重叠采集窗口的前体离子，这些前体离子在离子迁移率维度上仍然可以被分离(图3)。

通过研究15对插入肽对的重/轻比来评估prm-PASEF的绝对定量潜力。结合选择性和灵敏度，即使在低浓度下也能实现良好的信号检测(图7)。对ATVVYQGER重/轻对的详细分析表明，在浓度因子为2900(从17.2到注入的50,000 amol柱)的条件下，信号响应可以通过线性回归进行拟合。此外，根据与第一次校准曲线建立的校准曲线，对其中两次的浓度进行反算，定量限(LOQ)定义为80% <精度< 120%的最低浓度点，信号高于平均值(空白)+ 3X SD(空白)。

在这个实验中，在每个prm-PASEF框架内平均测量4个目标离子(图5b)，而不影响灵敏度和周期时间。当几个化合物在IMS和LC维度上重叠时，在连续的PASEF帧中测量它们(图4)。在一个prm-PASEF循环中，平均有4个不同的prm-PASEF帧。在最高的前体密度下，每个MS周期最多使用10帧(图5c)。每质谱周期的帧数并不影响灵敏度，但影响色谱峰的数据点数。尽管如此，色谱峰没有欠采样(图5d)，每个色谱峰数据点的中位数为25，表明实验可以在更短的梯度下进行。良好的峰取样和保留的灵敏度允许用正确的RSD测量所有峰的面积，即使没有内部标准归一化(图6)。