prm-PASEF

摘要

与标准选择和平行反应监测(SRM和PRM)相比，PRM - pasef增加了在单一获取方法中可以靶向的肽的数量，而不影响选择性或灵敏度。利用原型采集软件，我们将201个同位素标记的合成肽(AQUA肽)添加到100 ng的人HeLa细胞系消化中。prm-PASEF对一些肽的定量限为17,2 amol，使用的采集方法可以在30分钟的LC梯度上监测216个前体。该方法注射间重现性好，定量准确。

作者

安托万·莱苏尔¹, Pierre-Olivier Schmit²,克里斯托弗•亚当斯^3.Gunnar Dittmar¹；
1 LIH, Strassen，卢森堡;2 Bruker France S.A. Wissembourg，法国;3布鲁克道尔顿公司，美国圣何塞

关键词:

4D蛋白质组学、prm PASEF、timsTOF Pro、PASEF、LFQ、绝对定量、靶向蛋白质组学

靶向质谱是一种强大的技术，可以支持假设驱动的蛋白质组学实验，例如，在大样本队列中验证生物标志物候选。与依赖数据(DDA)和独立数据(DIA)的采集方法相比，它缓解了样本间缺失值的问题，但也提高了总体灵敏度。靶向蛋白质组以合成肽作为内标，对质谱信号进行归一化，最大限度地确定内源性肽的检测。

靶向蛋白质组学的一个主要限制是必须在单次测定的靶点数量、液相色谱分离的持续时间和总体灵敏度之间找到折衷。这在当前一代目标捕获方法（包括SRM和PRM）中仍然适用。因此，只有通过延长色谱分离时间或降低MS灵敏度和选择性，才能实现大量靶向肽的完整数据。DIA等替代方法可以部分解决这一问题，并依赖于使用宽m/z分离窗口对洗脱肽进行系统的共分离和共裂解。该方法测量大多数肽，但在可实现的MS循环期间（分析仪的扫描速度必须最小化）特异性和灵敏度有限（所有片段混合在一起），并且不容易与短色谱梯度相结合。

在本申请说明中，我们介绍了prm PASEF方法，这是PASEF获取策略的创新实现，克服了与当前靶向蛋白质组学技术相关的限制。

在人细胞系消化液(100 ng/µL)中添加201个重水合肽和15个轻合成肽，如图1所示。用15个重质AQUA多肽和它们的轻质多肽生成了从5.5到50,000 amol/µl的9个浓度点的稀释曲线。这一套多肽作为内部标准。其余186条AQUA多肽在所有样品中均以2 fmol/µl的恒定浓度添加。

样品和对照品以技术一式三份的形式注入，并在纳米HPLC（纳米洗脱，Bruker-Daltonics）上使用250mm拉式发射柱（IonOpticks，澳大利亚）进行分离，梯度为30min，梯度范围为2-30%乙腈。肽在以prm-PASEF模式运行的timsTOF Pro质谱仪（Bruker-Daltonics）上进行分析。本研究采用单一prm PASEF方法：tims累积时间固定为50 ms，而tims分离持续时间设置为100 ms。迁移率值范围为0.65-1.3 1/K₀覆盖的m/z范围为100-1700 m/z。每天使用Skyline处理数据（20.1.1.83）。

通过测量每个浓度水平下的15个重/轻比率，并通过确定各自的浓度精度和相对标准偏差，评估量化性能。作为质量控制，使用第一条曲线的线性回归反算两条曲线的浓度。定量限（LOQ）定义为80%以内的最低浓度点<准确度<120%，与高于平均值（空白）+3×SD（空白）的信号相关。

通过测量在恒定浓度下添加的186个重AQUA多肽的prm-PASEF痕迹的面积来评估复用性能。通过30次PRM - pasef运行计算色谱峰的面积和数据点数(使用最高的PRM过渡)的相对标准偏差(RSD)。

prm PASEF利用俘获离子迁移谱仪（tims）设备显著提高了该方法的复用能力。这使得目标收购的大规模并行化不会对快速LC和UHPLC实施的敏感性和更大的灵活性产生不利影响。tims细胞的捕获和洗脱原理（图2）允许在100分钟内获得所有在离子迁移度维度上顺序洗脱的靶肽 ms tims扫描事件。此外，时间聚焦效应增加了灵敏度，因为肽累积了100分钟 然后在5分钟内洗脱ms ms的峰值为ms。

216个前体的洗脱时间以30分钟的梯度在22分钟内分散。在prm-PASEF中，采集窗口是三维的，隔离窗口必须根据色谱洗脱时间、离子迁移率和四极子隔离m/z确定。当我们将每个前体的保留窗口设置为40 s时，它在LC保留时间维度上产生了大量重叠。然而，IMS维度减少了最终获取窗口重叠，如图5a所示。在相同的prm-PASEF框架内测量具有重叠采集窗口的前体离子，这些前体离子在离子迁移率维度上仍然可以被分离(图3)。

通过研究15对插入肽对的重/轻比来评估prm-PASEF的绝对定量潜力。结合选择性和灵敏度，即使在低浓度下也能实现良好的信号检测(图7)。对ATVVYQGER重/轻对的详细分析表明，在浓度因子为2900(从17.2到注入的50,000 amol柱)的条件下，信号响应可以通过线性回归进行拟合。此外，根据与第一次校准曲线建立的校准曲线，对其中两次的浓度进行反算，定量限(LOQ)定义为80% <精度< 120%的最低浓度点，信号高于平均值(空白)+ 3X SD(空白)。

在本实验期间，在每个prm PASEF帧内（图5b）测量了4个目标离子的平均值，而不影响灵敏度或循环时间。当几个化合物在IMS和LC维度上重叠时，它们在连续的PASEF帧中进行测量（图4）。平均而言，在一个prm PASEF循环中有4个不同的prm PASEF帧。在最高的前体密度下，每毫秒周期最多使用10帧（图5c）。每MS周期的帧数不影响灵敏度，但影响定义色谱峰的数据点的数量。尽管如此，没有色谱峰取样不足（图5d），每个色谱峰的数据点中值数为25，这表明可以用更短的梯度进行实验。良好的峰取样和保持的灵敏度允许使用正确的RSD测量所有峰面积，即使没有内部标准归一化（图6）。