prm-PASEF

摘要

与标准选择和平行反应监测（SRM和PRM）相比，PRM PASEF增加了单一采集方法中可靶向的肽的数量，而不会影响选择性或灵敏度。使用原型采集软件，我们将201个同位素标记的合成肽（水肽）加入100 ng人类HeLa细胞系消化物中。prm PASEF优于某些肽的17,2 amol定量限值，其采集方法可在30 min LC梯度上监测216个前体。新的prm PASEF方法在两次进样之间具有很高的再现性，能够进行准确的定量。

作者

安托万·莱苏尔^1.，皮埃尔·奥利维尔·施密特^2.，克里斯托弗·亚当斯^3.,贡纳·迪特玛^1.;
1. 卢森堡斯特拉森LIH；2. Bruker France S.A.Wissembourg，法国；3. Bruker Daltonics公司，美国圣何塞

关键词：

4d -蛋白组学，prm-PASEF, timsTOF Pro, PASEF, LFQ，绝对定量，靶向蛋白组学

靶向质谱是支持假设驱动的蛋白质组学实验的强大技术，例如，在大样本队列中验证候选生物标记物。与数据相关（DDA）和数据独立（DIA）采集方法相比，它减轻了样本之间缺失值的问题，但也提高了总体灵敏度。靶向蛋白质组学使用合成肽作为内部标准，以使MS信号正常化，并以最大置信度确认内源性肽的检测。

靶向蛋白质组学的一个主要限制是必须在单次测定的靶点数量、液相色谱分离的持续时间和总体灵敏度之间找到折衷。这在当前一代目标捕获方法（包括SRM和PRM）中仍然适用。因此，只有通过延长色谱分离时间或降低MS灵敏度和选择性，才能实现大量靶向肽的完整数据。DIA等替代方法可以部分解决这一问题，并依赖于使用宽m/z分离窗口对洗脱肽进行系统的共分离和共裂解。该方法测量大多数肽，但在可实现的MS循环期间（分析仪的扫描速度必须最小化）特异性和灵敏度有限（所有片段混合在一起），并且不容易与短色谱梯度相结合。

在本应用说明中，我们提出了prm-PASEF方法，该方法是PASEF获取策略的创新实现，克服了当前靶向蛋白质组学技术的限制。

如图1所述，人类细胞系消化物（100 ng/µL）中加入201种重水肽和15种轻合成肽。使用15种重水肽及其轻对应物生成了9个浓度点的稀释曲线，范围为5.5至50000 amol/µl。这组肽用作内标物。在所有样品中，以2 fmol/µl的恒定浓度加入其他186种水肽。

样品和对照按技术重复的三份注入，用纳米高效液相色谱(nanoElute, Bruker Daltonics)进行分离，使用250 mm拉式发射柱(IonOpticks，澳大利亚)，梯度为30分钟，梯度范围为2-30%的乙腈。在prm- PASEF模式下运行的timsTOF Pro质谱仪(Bruker Daltonics)上分析肽段。本研究采用单一的prm-PASEF方法:定时积累时间固定为50 ms，定时分离时间设置为100 ms。迁移率值范围为0.65 ~ 1.3 1/K₀覆盖的m/z范围为100-1700 m/z。数据使用Skyline-daily(20.1.1.83)进行处理。

通过测定各浓度水平的15个重/轻比，并确定各自的浓度准确度和相对标准偏差来评价量化性能。作为质量控制，用第一条曲线的线性回归反求两条曲线的浓度。定量限(LOQ)定义为与高于平均值的信号(空格)+3×SD(空格)相关的80% <准确度< 120%范围内的最低浓度点。

通过测量恒定浓度下添加的186种重水肽的prm PASEF痕迹面积，评估复用性能。在30次PRM PASEF运行过程中，计算面积的相对标准偏差（RSD）和色谱峰上的数据点数量（使用最高PRM转换）。

prm-PASEF利用捕获离子迁移谱(tims)器件显著增加了该方法的多路复用能力。这使得大规模的目标收购并行化，对灵敏度没有不利影响，并且使用快速LC和UHPLC实现更大的灵活性。tims细胞的捕获和洗脱原理(图2)允许在100 ms的tims扫描事件中获得所有目标肽，这些肽在离子迁移率维度中依次洗脱。此外，时间聚焦效应提高了灵敏度，因为积累了100 ms的多肽被5 ms洗脱到ms。

216个前体的洗脱时间以30分钟的梯度分布在22分钟内。在prm PASEF中，采集窗口是三维的，必须根据色谱洗脱时间、离子迁移率和四极分离m/z定义分离窗口。当我们将保留窗口设置为40时 对于每个前体，它在LC保留时间维度上产生了大量重叠。然而，IMS尺寸减少了最终采集窗口重叠，如图5a所示。在相同的prm PASEF框架内测量具有重叠采集窗口的前体离子，这些前体离子仍然可以在离子迁移率维度上分离（图3）。

通过研究15个加标肽对的重/轻比，评估prm PASEF的绝对定量潜力。选择性和灵敏度的结合使得即使在低浓度下也能进行良好的信号检测（图7）。对ATVVYQGER重/轻对的详细分析表明，信号响应可通过2900浓度因子（17.2至50000 amol注入柱）的线性回归拟合。此外，根据第一份样品建立的校准曲线，对其中两份样品的浓度进行反向计算，确认在所有浓度下，定量准确度可达到±20%（表1）。定量限（LOQ）定义为与高于平均值（空白）+3X SD（空白）的信号相关的80%<准确度<120%范围内的最低浓度点。

在本实验中，在每个prm-PASEF帧内平均测量4个目标离子(图5b)，而不影响灵敏度和周期时间。当几个化合物在IMS和LC维度上重叠时，它们在连续的PASEF帧中进行测量(图4)。平均而言，在一个prm-PASEF周期中有4个不同的prm-PASEF帧。在前驱体密度最高的情况下，每MS循环最多使用10帧(图5c)。每个MS周期的帧数不会影响灵敏度，但会影响定义色谱峰的数据点的数量。尽管如此，色谱峰没有欠采样(图5d)，每个色谱峰的数据点的中位数为25，说明可以在更短的梯度下进行实验。良好的峰采样和保持灵敏度，使得即使没有内部标准归一化，也可以用正确的RSD测量所有峰面积(图6)。