timsTOF专业2

基于质谱（MS）的蛋白质组学是鉴定和定量数千种蛋白质的首选方法。然而，由于当前质谱仪的速度、灵敏度和分辨率有限，蛋白质组的全面覆盖仍然具有挑战性。

timsTOF Pro 2使用并行累积串行碎片(PASEF^®)采集方法提供极高的速度和灵敏度，只需最少的样本量即可达到蛋白质组学的新深度。

捕获离子迁移谱（TIMS）首先是一种气相分离技术。除高效液相色谱法（HPLC）和质谱法外，还通过增加分离维度解决了样品的复杂性，增加了峰容量和化合物表征的可信度。

同样重要的是，TIMS装置还可以积累和浓缩给定质量和流动性的离子，从而实现了灵敏度和速度的独特提高。

双TIMS技术可实现接近100%的占空比，有助于前部的累积，而后部的离子则根据其流动性依次释放。这种并行累积-串行分段（PASEF）过程^®)实现碰撞截面(CCS)分析。

ccs支持的分析打开了许多进一步的分析可能性，从更大的复合识别的确定性，到有信心的库匹配和更低的错误发现率(FDRs)在大型数据集。

介绍timsTOF Pro 2质谱仪和我们最新一代的TIMS分析仪，以及一个经过彻底改造的不锈钢叠层环离子导管（SRIG）。新设计提供了3倍更高的离子容量。一种用于离子预处理和改进的离子注入四极的新型离子冷却多极，以及进一步简化的离子光学系统，用于更有效地将离子从TIMS电池传输到TOF分析仪，进一步最大化离子传输和灵敏度（MS和PASEF MS/MS）。

TIMS电池的独特设计意味着离子根据其迁移率从TIMS分析仪的第二部分释放，而更多进入的离子可以在TIMS分析仪的第一部分并行累积。
这种并行累积技术实现了近100%的占空比，几乎没有离子损失。

重新设计MS/MS技术以满足蛋白质组学的速度要求。使用捕获离子迁移光谱法分离肽离子，洗脱（~100 ms）并在四极飞行时间（QTOF）中检测，生成TIMS-ms热图。在并行累积串行分段（PASEF）中^®)方法使用相同的TIMS分离：四极在洗脱过程中分离某一离子物种，并立即转移到下一前体。父谱和片段谱通过迁移率值对齐。

PASEF^®该技术可达到>100 Hz的测序速度，通过多次筛选可提高低丰度肽段的质谱质量。

PASEF^®：非常适合鸟枪蛋白质组学
由PASEF驱动的timsTOF Pro 2^®在不损失灵敏度或分辨率的情况下，提供>100 Hz的测序速度。这是通过使四极隔离质量窗口与TIMS漏斗中特定肽包的洗脱时间同步来实现的。

需要最少的清洁
许多用于蛋白质组学应用的MS仪器在大样本队列上每天24小时运行时需要每月清洁一次。性能下降是不可能的

即使在较短的时间内也会明显。timsTOF Pro 2卓越的鲁棒性意味着该仪器可以在数周内全天候运行，而不会出现明显的灵敏度损失或其他性能指标。

PaSER (Parallel Search Engine in Real-time)是一种硬件和软件相结合的解决方案，能够完全集成实时数据库搜索和基于样本队列的结果管理。

PaSER以毫不妥协的速度提供结果，包括PTM搜索。通过使用基于GPU的搜索，PaSER可以在实时或离线模式下提供相同的结果，而无需使用简化的算法或中间过程。PaSER的这种毫不妥协的搜索速度使您可以在采集结束后几秒钟内，随时查看结果，运行并完成！PaSER有效地消除了大样本队列和更大吞吐量带来的数据分析瓶颈。

此外，还可以通过PaSER获取的数据集进行实时LFQ量化，从而实现向定量蛋白质组学的瞬时过渡。使用TIMS Viz可视化偏移质量对齐(MOMA)功能，使用户能够立即识别和表征只有4D-Omics可见和可识别的等压和近等压多肽。

DIA -PASEF将PASEF原理应用于数据独立采集，结合了DIA的优点和PASEF固有的离子效率，比传统的DIA方法更加敏感和有选择性。

TIMS分离提高了选择性，排除了碎片中的单电荷前体，并通过集中噪声信号来净化样品。

利用分子量的相关性和来自双TIMS漏斗的CCS编码信息，dia PASEF可实现最可靠的化合物识别。在整个LC-MS/MS过程中，dia PASEF运行一个完美的数据长方体，包含m/z、离子迁移率（CCS）、保留时间和强度。

timsTOF Pro 2凭借稳健的SRIG（堆叠环离子引导）配置和新的优化标准dda PASEF方法，在单次激发蛋白质组学中提供了前所未有的蛋白质组覆盖深度。使用Aurora-25 cm柱，在60分钟梯度下，从200 ng的内部HEK胰蛋白酶消化液中，鉴定出7000多个蛋白质组和60000多个肽。

因此，timsTOF Pro 2通过数据库搜索和运行之间的匹配，无需任何光谱库，为日常细胞系蛋白质组量化实验提供了深入的蛋白质组覆盖。不同的数据库搜索策略会得到非常相似的结果。PaSER和MaxQuant在蛋白质和多肽水平上获得了相似的ID号。

与标准选择和平行反应监测(SRM和PRM)相比，PRM - pasef增加了在单一获取方法中可以靶向的肽的数量，而不影响选择性或灵敏度。

靶向质谱（MS）是一种用于蛋白质组学实验的强大技术——例如，在大样本队列中验证候选生物标记物。与数据相关采集（DDA）和数据独立采集（DIA）相比，这提高了灵敏度。该技术受到单次运行中测量的目标数量、液相色谱分离阶段持续时间和整体灵敏度之间必要折衷的限制。只有通过延长色谱分离时间或降低MS灵敏度和选择性，才能获得大量靶向肽的完整数据。

prm PASEF通过利用Bruker的timsTOF Pro 2进行第四维分离以提高选择性和灵敏度，增加PASEF的速度以增加前体靶点的数量，从而增加了单次采集中可靶向的肽的数量。

使用低样本量进行蛋白质组量化对于越来越多的生物学应用至关重要，如特殊细胞、稀有细胞群或细针穿刺肿瘤活检。使用灵敏的质谱仪对如此低的样本量进行蛋白质组定量是至关重要的。从Aurora-25 cm柱上30分钟梯度测量的20 ng HeLa（Pierce）肽中，实时搜索引擎PaSER识别出4200多个蛋白质组和近30000个肽。

使用标准dia-PASEF方法进行数据独立采集，可在多次运行中提供可重复的识别。三种不同的dia-PASEF窗口方案允许使用aurar -25cm色谱柱在60分钟梯度中对近8000个蛋白质组和超过70000个肽序列进行定量，同时证明了定量精度。

CCS能够量化近端磷酸化位点
timsTOF Pro 2上dia-PASEF的高灵敏度、测序速度和再现性甚至可以实现有限样本量的定量磷酸蛋白质组学分析。从小鼠大脑样本中获得的总蛋白量仅为25μg，无标记定量磷酸化蛋白质组是可行的。使用30 SPD（每天样本数）Evosep方法对富集磷酸肽进行dia PASEF分析，在三个富集重复中鉴定出多达4473个独特的磷酸肽。这些结果为针活检的应用提供了进一步的希望，为癌症蛋白质基因组学数据补充了信号转导方面的信息。结果由Stefan Tenzer教授提供。

在样本量有限的情况下分析细胞信号
在色谱共洗脱时，由于等压性质和信号叠加，在没有CCS信息的传统蛋白质组学方法中，磷酸肽(p肽)异构体的定量是不可能的。从标准的150 μg基于二氧化钛的富集工作流程中，PASEF分析识别出27,768个磷酸肽，如右图所示，并揭示了使用迁移偏移质量对齐(MOMA)技术进行离子迁移分离的好处。自1946年鉴定出共洗脱异构体以来，20%的异构体可以通过TIMS完全分离，从而更好地了解蛋白质近端磷酸化位点。