timsTOF SCP

高级离子光学和PASEF从单个细胞研究细胞异质性和生物学
质谱蛋白质组学已成为了解生物功能和疾病机制的现代研究的主要内容。看似同质的健康或患病组织由具有多种不同蛋白质组的细胞组成。破译每个细胞蛋白质组的挑战——细胞异质性——是充分理解其功能的关键。
timsTOF SCP提供了一种彻底改进的离子源概念。结合并行累积串行分段（PASEF^®)在获取方法上，它提供了极高的速度和灵敏度来处理单个细胞的蛋白质组或少数形态或功能相似的细胞的翻译后修饰。

timsTOF SCP采用改进的离子源几何结构，包括1 mm毛细管识别，可将5倍以上的离子转移到额外的高压级离子漏斗和8级差分泵真空系统中。

较大的毛细管产生超高灵敏度，额外的正交离子反射和随后的漏斗提供了一个单独的差分泵级，保持了timsTOF仪器系列预期的系统稳健性。

timsTOF SCP改进了离子向源的传输，同时增加了更高压力的真空级，保持了稳定性。这使得离子电流几乎提高了5倍。当与Evosep结合时，一个耳语法以100 nL/min的流速运行，且直径-

PASEF方法，灵敏度增益约为100倍，比以前使用Evosep One的高流量结果。这使得真正的单细胞水平上的无偏蛋白质组学具有良好的再现性、鲁棒性，并且首次覆盖每个细胞约1500个蛋白质。

捕获离子迁移谱（TIMS）首先是一种气相分离技术。除高效液相色谱法（HPLC）和质谱法外，还通过增加分离维度解决了样品的复杂性，增加了峰容量和化合物表征的可信度。

同样重要的是，TIMS装置还可以聚集和浓缩给定质量和流动性的离子，从而实现灵敏度和速度的独特提高。
双TIMS技术可实现接近100%的占空比，有助于前部的累积，而后部的离子则根据其流动性依次释放。这种并行累积-串行分段（PASEF）过程^®)启用碰撞横截面（CCS）分析。

支持CCS的分析开辟了许多进一步的分析可能性，从更确定的化合物识别到可靠的库匹配以及在大型数据集中更低的错误发现率（FDR）。

除了无偏见的真正单细胞蛋白质组学应用外，timsTOF SCP还为涉及从蛋白质组富集肽的工作流程提供了卓越的灵敏度。免疫肽组学研究始于从血浆或组织中纯化免疫肽。

由于免疫肽在这些样本中的丰度相对较低，timsTOF SCP是新抗原发现中可用材料有限的免疫肽组学的理想选择，如针活检。timsTOF SCP还具有革命性的敏感性，可用于研究癌症信号通路的磷酸化蛋白质组学。

使用捕获离子迁移谱（TIMS）分离肽离子，洗脱（~100 ms）并在四极飞行时间（QTOF）中检测，生成TIMS-ms热图。在PASEF中^®方法使用相同的TIMS分离，四极在洗脱过程中分离特定离子物种，并立即转移到下一前体。父谱和片段谱通过迁移率值对齐。

并行累积串行分段（PASEF）^®)该技术可实现大于100 Hz的测序速度。使用PASEF^®通过多次选择，提高低丰度肽的MS/MS光谱质量。

帕塞夫^®：非常适合鸟枪蛋白质组学
由PASEF供电的timsTOF SCP^®提供>100 Hz的测序速度，而不会失去灵敏度或分辨率。这是通过使四极隔离质量窗口与TIMS漏斗中特定肽包的洗脱时间以及碰撞细胞中的碰撞能量同步来实现的。

timsTOF SCP允许在测序速度超过100 Hz且蛋白质组深度不受影响的情况下，以最小样本量（<200 ng）分析数百个样本。这改变了蛋白质组学的研究方式，但增加的数据需要新的数据分析水平。

数据分析是许多工作流中的常见瓶颈。现代分析方法产生了由timsTOF SCP生成的数百行数据。Bruker引入了实时数据库搜索功能——实时并行数据库搜索引擎（PaSER），消除了这一障碍。使用PaSER，LC-MS运行一完成，结果即可用–有效运行并完成。

开放式文件数据格式允许研究人员直接处理原始数据，并使用他们选择的行业领先软件。

Bruker的MaxQuant软件已经过调整，可以管理由保留时间、离子迁移率、质量和信号所跨越的空间中的四维（4D）特征

强烈这有利于识别和量化肽、蛋白质和翻译后修饰。

PEAKS Studio将从头排序与传统数据库搜索相结合，并针对处理timsTOF原始数据进行了优化。

支持CCS的自信识别分析
timsControl允许定制dia PASEF窗口方案，重点关注

感兴趣的离子。调整质量隔离宽度、TIMS范围和循环时间，使dia PASEF适应不同的色谱方法。

将Evosep One系统上的低流量液相色谱法与Whisper和timsTOF SCP上dia PASEF的高灵敏度相结合，从500 pg的细胞消化液中鉴定出2000多种蛋白质，从250 pg中鉴定出1500种蛋白质，证明了真正的单细胞蛋白质组学所需的灵敏度。从250 pg中鉴定的蛋白质覆盖了大约4个数量级的丰度范围，实现了单细胞水平的定量蛋白质组分析。

了解TME及其浸润性免疫细胞可被视为影响疾病进展、治疗反应和患者生存的关键步骤。由于其高灵敏度，timsTOF SCP可使激光捕获显微切割（LMD）切除的细胞具有足够的蛋白质组深度来自FFPE组织样本。右图显示了典型的工作流程。

细胞标记物用于识别肿瘤块中的黑色素瘤癌细胞以及与基质密切相关的黑色素瘤癌细胞，随后通过LMD和timsTOF SCP仪器上的无偏4D蛋白质组学分析分离这两个群体。

关键发现：富集分析显示中枢和外周黑色素瘤细胞之间存在差异调节蛋白，有可能进行疾病亚型分析，以指导临床决策。
结果由Matthias Mann教授提供（内政部：https://doi.org/10.1101/2020.12.22.423933)